Rapport 2003-1
Auteurs: Anton S.M. Sonnenberg, Brian Lavrijssen
Dit project beschrijft het onderzoek dat is uitgevoerd om duidelijk bewijs te verkrijgen of de symptomen die we de laatste 3 jaar vaak in Nederlandse teelten zien (bruinverkleuring) veroorzaakt wordt door één of meerdere virussen.
In de projecten 220096 en 220142 zijn de volgende zaken uitgevoerd:
- Het erfelijk materiaal (dsRNA’s) van het virus (virussen) in monsters met bruinverkleuring is geanalyseerd en gekarakteriseerd.
- Monsters uit teelten met en zonder symptomen zijn onderzocht op aanwezigheid van dsRNA om een verband te kunnen aantonen tussen de aanwezigheid van het virus en symptomen.
- Via het virusvrij maken van stammen en overdracht van virus is getracht te voldoen aan de postulaten van Koch (bewijs dat virus oorzaak is van de symptomen).
Samenvatting van de uitkomsten van dit onderzoek:
- Monsters met bruinverkleuring, waarbij de hoed egaal is verkleurd van zeer licht tot duidelijk bruin, bevatten virale dsRNA’s. Het bandenpatroon telt 15 tot 17 banden (figuur 1 en 2).
- Circa 13 banden lijken onderdeel te zijn van één grote band; dat geeft aan dat we hier te maken hebben met één virus (naast het onschuldige virus dat we altijd al in champignons hebben gevonden).
- De grotere dsRNA’s worden ook met enige regelmaat gezien in monsters zonder symptomen (figuur 1). Dit zijn de dsRNA’s VX3 t/m de VXXL banden. We noemen deze banden dan ook niet-symptomatisch.
- De kleinere dsRNA’s (VX4 t/m VX8) zijn duidelijk gecorreleerd aan symptomen. Dat wil zeggen, als de hoed bruin verkleurd is dan zijn deze dsRNA’s aanwezig. De intensiteit van de banden geeft ook een redelijk goede correlatie met mate van bruinverkleuring (hoe bruiner, des te intenser de banden). Deze banden noemen we dan ook symptomatisch (figuur 1).
- De bruinverkleuring is het enige symptoom dat duidelijk gecorreleerd is met bepaalde dsRNA’s. Dit symptoom is alleen te zien aan het oppervlak van de hoed. Opvallend is dat de concentratie van de virale dsRNA banden hoger is in deze opperhuid dan in de rest van de paddestoel.
- Er is een gevoelige test gemaakt om de symptomatische dsRNA te kunnen detecteren. Deze test is gebruikt om te controleren of stammen met twee methoden virusvrij gemaakt kunnen worden. Hoewel de test aangeeft dat er in het mycelium geen dsRNA zit verschijnen ze weer in de paddestoelen wanneer met deze stammen een teelt wordt uitgevoerd. Er kunnen hiervoor drie verklaringen mogelijk zijn:
- De concentratie van het virus in de virusvrij gemaakte stammen is zo laag geweest dat de test dit niet heeft kunnen detecteren.
- De virusvrij gemaakte stammen zijn in de teelt besmet door de virusbevattende controle stammen.
- De test detecteerd niet de juiste dsRNA’s.
- Het bovenstaande betekent in ieder geval dat we niet in staat waren om aan te tonen dat met het verwijderen van het virus ook de symptomen verdwijnen.
- We hebben compost van een tunnelbedrijf gebruikt dat voortdurend last had van bruinverkleuring. In teeltproeven kon noch met entbare noch met doorgroeide compost van dit bedrijf symptomen worden overgebracht.
Het onderzoek wijst uit dat de kleinere symptomatische dsRNA’s onderdeel zijn van de grotere niet-symptomatische banden. Dat betekent dat bij het optreden van symptomen het erfelijk materiaal zich anders vermenigvuldigt dan wanneer er geen symptomen zijn. Dat is echter nog geen bewijs dat de symptomen ook veroorzaakt worden door het virus.
De uitgevoerde analyses en proeven wijzen in de richting van een associatie van het virus met symptomen en niet op een causaal verband tussen het virus en de symptomen. Het virus lijkt altijd (op de achtergrond) aanwezig te zijn. Slechts onder bepaalde omstandigheden wordt de concentratie van de dsRNA’s hoger zodat deze goed zichtbaar worden. Deze verhoging in concentratie gaat blijkbaar niet altijd gepaard met symptomen (als het om de grotere dsRNA’s gaat). Pas als ook de kleinere dsRNA’s (VX4 t/m VX8) in concentratie toenemen (of voor het eerst verschijnen) ontstaan er duidelijk symptomen (bruinverkleuring). De toename in de concentratie van dsRNA’s lijkt dus door een externe factor (stress?) te worden veroorzaakt. Daarbij is niet zeker of de symptomen ook door deze factor ontstaan of juist door de aanwezigheid (of toename) van deze dsRNA’s. In het laatste geval zou het nuttig zijn om verdere pogingen te ondernemen om stammen virusvrij te maken. Daarvoor zou echter meer van het virus gekloneerd moeten worden zodat we een meer betrouwbare test hebben om stammen op aanwezigheid van virus te testen. De test zou niet goed hebben kunnen werken door het feit dat we nu voor dat gedeelte van het erfelijk materiaal van het virus testen dat zich niet zo makkelijk leent voor een RT-PCR test. Soms zijn dsRNA moleculen slecht te denatureren (enkel strengs te maken). Als dat niet goed lukt werkt een RT-PCR test niet optimaal.
Figuur 1. dsRNA patronen in monsters met symptomen (laan 1 en 2) en in monsters zonder symptomen (laan 3 en 4). Vaak zijn de concentraties van de dsRNA’s in monsters zonder symptomen lager dan hier aangegeven. Het onderzoek heeft duidelijk gemaakt dat alleen de kleinere dsRNA’s (VX4 t/m VX8) een goede correlatie hebben met het meest voorkomend symptoom (bruinverkleuring). |
In het project zijn geen analysen gedaan om te achterhalen welke externe factoren een rol kunnen spelen bij het ontstaan van de symptomen. Dat lijkt op het eerste gezicht ook niet makkelijk. Er kunnen zoveel factoren zijn of combinaties van factoren dat de zoektocht ernaar onbegonnen werk lijkt. Bedrijfsbegeleiders en voorlichters hebben echter aanwijzingen die in de richting van een niet optimale verdamping wijzen als één van de mogelijke oorzaken. Het zou nuttig zijn om de verdamping te meten in teeltbedrijven die nog steeds last hebben van de bruinverkleuring en deze te vergelijken met bedrijven zonder problemen. Dat kan gebeuren met de nu gebruikte methoden waarbij gekeken wordt naar temperatuurverschillen tussen bed en lucht, of waarbij de verschillende input- en outputparameters van cellen worden bepaald (WVC). Op dit moment beschikt de Plant Sciences Group (waarvan PPO, PRI en het departement Plantwetenschappen van Wageningen Universiteit deeluitmaken) over een infraroodcamera waarmee in principe kleine temperatuursverschillen aan oppervlaktes gemeten kunnen worden. De temperatuur van een oppervlakte is direct gerelateerd aan de verdamping van dat oppervlak. Op deze manier kunnen kleine verschillen in verdamping worden gemeten tussen champignons die naast elkaar op een bed staan. Wellicht kan er op deze manier een correlatie gelegd worden tussen verdamping en de mate van bruinverkleuring.
Welk mechanisme de hoed verkleurt is ook nog niet duidelijk. Van champignons is bekend dat de gebruikelijke verkleuring wordt veroorzaakt door het enzym tyrosinase. Er zijn goede methoden om de activiteit van dit enzym te meten. Op deze manier is misschien te achterhalen of dit enzym inderdaad bij de bruinverkleuring is betrokken. Van het enzym is al het een en ander bekend. Bijvoorbeeld door welke factoren het enzym actief wordt. Op deze manier kunnen we aanwijzingen krijgen in welke richting we de externe factor moeten zoeken.
Financier: Productschap Tuinbouw.
>> Vraag het volledige rapport aan bij Productschap Tuinbouw: www.tuinbouw.nl